CRISPR Cas9 und seine Funktionsweise

Ausgangspunkt der CRISPR Cas9 Methode war die Entdeckung von sogenannten „clustered regularly interspaced short palindromic repeats“, kurz CRISPR. Dies ist ein besonders langes Wort, dass man zunächst erstmal in seine Bestandteile zerlegen sollte. In erster Linie handelt es sich hierbei um kurze palindromische Wiederholungssequenzen. Zur Wiederholung: eine palindromische Sequenz zeichnet sich durch eine gleiche Basenabfolge, in der selben Richtung, an beiden Enden einer doppelsträngigen DNA-Sequenz aus. Diese kurzen palindromischen Wiederholungssequenzen sind wiederum durch andere Genomabschnitte in regelmäßigen Abständen unterbrochen. Im Laufe der Erforschung dieser CRISPR Sequenzen fand man zusätzlich heraus, dass es sich bei diesen zuvor genannten Füllsequenzen um Abschnitten mit viralen Ursprung handelte. Dies war ein Hinweis auf dr Ursprung des Systems. Außerdem treten sie in spezifischen Stellen besonders oft, also in einem Cluster (engl. für „Haufen“) auf.

Die CRISPR Cas9 Methode

Bakterien und Archaen besitzen ein adaptives Immunsystem, welches dazu dient sie vor fremden Viren oder Plasmiden zu verteidigen. Das Protein Cas9 fungiert dabei wie eine Genschere: nach der Bindung an die Genom-DNA wird diese in Zusammenarbeit mit einer Guide-RNA (gRNA) sequenzspezifisch geschnitten. (Ursprünglich bindet das Cas9 Protein eine Struktur aus zwei RNAs: die crRNA und die tracrRNA. Die crispr-RNA (crRNA) ist eine 17-20-Nukleotidsequenz lange RNA. Ihre Sequenz ist komplementär zur Ziel-DNA. Ihr Partner, die tracr-RNA, erfüllt eine stabilisierende Wirkung für die Cas9 Nuklease. In späteren Anwendung sind Wissenschaftler dann auf die Verwendung einer einzelen single guide RNA, kurz sgRNA, umgestiegen.) Die Folgen sind Doppelstrangbrüche die repariert werden müssen. Diese Reparatur geschieht mittels Homologiematrizen (HDR) oder durch fehleranfällige nicht homologe Endverbindungen (NHEJ). In der Genom-DNA bleiben danach dann kleine Insertionen, Deletionen oder eine komplett neue Sequenz wird eingefügt.

Das CRISPR Cas9 System ermöglicht mittels zielgerichteter DNA Doppelstrangbrüche die Veränderung des Genoms. Die Begriffe NHEJ (*Non-homologous end joining* ) und HDR (*homology directed repair*) beschreiben in der Abbildung die unterschiedlichen Möglichkeiten der Reparatur.
Bildquelle: https://de.wikipedia.org/wiki/CRISPR/Cas-Methode#/media/Datei:16_Hegasy_DNA_Rep_Wiki_D_CCBYSA.png

Dies CRISPR Cas9 Methode kann zu dem durch ein katalytisch inaktives Cas9 (ein totes Cas9, Abk.: dCas9) ergänzt werden. Während dieses Cas9 Protein seine Nukleaseaktivität verloren hat, besitzt es immer noch die Fähigkeit zur Bindung an DNA-Stränge. Einsatz findet diese Abwandlung der CRISPR Cas9 Methode z.B. in der Transkriptionsaktivierung oder -repression. Darüber hinaus bieten Technologien auf Basis von CRISPR Cas9 ein praktisches Werkzeug, um durch die Einführung mehrerer sgRNAs (single guide RNAs) mehrere Loci gleichzeitig anzusprechen.

Die CRISPR Cas9 in der Gentherapie

Dass es sich bei der Entdeckung dieses Systems um eine Revolution für die Genome-Editierung handelt, steht außer Frage. Inzwischen findet es u.a. Einsatz im zielgerichteten Knockout von Genen. Ein limitierender Faktor ist allerdings die Voraussetzung der Zellteilung: die Reparatur des künstlich erzeugten Schadens geschieht nur in sich teilenden Zellen. Hinzu kommt die Spezifität, also die Zielsicherheit des Systems. Eine falsche und somit unkontrollierte Bindung des CRISPR Cas9 Komplexes könnte verheerende Folgen im Genom anrichten. Als mögliche Ausweg hat die Forschergemeinde allerdings die zeitliche Begrenzung der Aktivität des Systems ins Auge gefasst. Für die zielgerichtete Gentherapie muss zudem festgelegt werden wie das Cas9 Protein zum „Tatort“ gelangt.

Ein besonders interessanter Abschnitt bezüglich möglicher Transportvehikel und der Hindernisse findet sich unter https://www.mpg.de/11033456/crispr-cas9-therapien.